معرفی آزمایشات الایزا

نام آزمایش: G6PD نوزادی (Neonatal G6PD)

معرفی تست: هدف از انجام این آزمایش، غربالگری و تشخیص کمبود آنزیم گلوکز 6-فسفات دهیدروژناز یا G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) است.

آنزیم  G6PD در تولید انرژی دخیل است. این آنزیم در تمام سلول ها، از جمله گلبول های قرمز یافت می شود و به محافظت از آنها در برابر برخی مواد جانبی سمی که در متابولیسم سلولی تولید می شوند، کمک می کند. کمبود G6PD باعث می شود که گلبول های قرمز در شرایط خاصی مستعد همولیز شوند. همولیز در افراد درجات متفاوتی دارد. البته این بیماری وابسته به جنسیت است و همراه با کروموزوم X جابجا و منتقل می‌شود، به همین علت این بیماری بیشتر در مردان مشاهده می‌شود. افرادی که این وضعیت را به ارث برده اند، زمانی که در معرض شرایط محرک مانند استرس، عفونت، برخی داروها یا برخی مواد غذایی قرار گیرند، تغییرات قابل توجهی در ساختار لایه بیرونی (غشای سلولی) گلبول های قرمز خون آنها رخ می دهد. برخی از افراد زمانی که در معرض دانه های باقالا قرار گیرند، شرایطی به نام فاویسم یا حساسیت به باقالا را تجربه می کنند. با این تغییرات، گلبول های قرمز می توانند به سادگی شکسته شوندکه منجر به کاهش تعداد گلبول های قرمز خواهد شد. در این شرایط اگر بدن قادر به تولید گلبول های قرمز کافی نباشد، آنمی همولیتیک ایجاد می شود و فرد ممکن است دچار زردی، ضعف، خستگی و یا تنگی نفس شود.

ضرورت انجام تست: این تست جز تست های غربالگری می باشد و می بایست در سن 3 الی 5 روزگی نوزاد انجام شود در موارد غیرغربالگری زمانی که کودک زردی مقاوم داشته باشد مثل زردی مقاوم نوزادان، در مواقعی که فرد حملات بینابینی همولیزی داشته باشد که با عفونت یا بعضی داروها ظاهر شود.

نوع نمونه: لکه خون خشک شده بر روی کاغذ واتمن (DBS)

نحوه جمع آوری نمونه: برای نمونه گیری آمادگی خاصی لازم نیست، در صورتیکه شخصی علامت حاد داشته باشد توصیه می شود چند هفته بعد از بهبودی نمونه گیری انجام شود.

در صورتی که نیاز به انتقال خون باشد، باید ابتدا خونگیری جهت آزمایش G6PD انجام شده و سپس انتقال خون صورت گیرد.

این آزمایش از طریق نمونه گیری از پاشنه ی پا در نوزادان تازه متولد شده و خون وریدی یا از طریق خون نوک انگشت برای سایرین و انتقال آن بر روی کاغذ گاتری قابل انجام است.

شرایط نگهداری نمونه قبل از انجام آزمایش: نمونه بعد از خشک شدن در دمای اتاق، می بایست همراه با سیلیکاژل در زیپ کیپ قرار داده شود و تا قبل از انجام آزمایش در یخچال نگهداری شود.

اساس آزمایش (نوع تکنیک، آماده سازی نمونه، واحد اندازه گیری):

آنزیم G6PD در محیط تامپونی مناسب باعث احیای NADP و تبدیل آن به NADPH می گردد. NADPH بوجود آمده زیر لامپ ماوراء بنفش (UV) با طول موج 365 نانومتر ایجاد فلئورسانس می کند. شدت این فلئورسانس در خون افراد سالم زیاد و در خون بیماران مبتلا به نقص آنزیم G6PD کم و یا منفی است.

مدت زمان فرآیند آزمایش در مرکز تحقیقات رشد و تکامل: یک هفته   

چگونگی تفسیر نتایج: نمونه های طبیعی خون با بیش از 80% گلبول سالم، دارای فلئورسانس قوی و خون های کمتر از 40% گلبول سالم، فاقد فلئورسانس می باشد. در محدوده بیناینی، شدت فلئورسانس به تناسب متفاوت خواهد بود. از نقطه نظر فعالیت آنزیمی، نمونه هایی که دارای فعالیتی برابر 9 واحد در گرم هموگلوبین یا بیشتر می باشند دارای فلئورسانس قوی و نمونه های کمتر از 3 واحد، فاقد فلئورسانس خواهند بود.

نام آزمایش: گالاکتوز نوزادی (Neonatal Galactose)

معرفی تست: آزمایش گالاکتوز نوزادی یک آزمایش خون است که برای بررسی یک اختلال ژنتیکی نادر به نام گالاکتوزمی در نوزادان انجام می شود. گالاکتوزمی یک اختلال مادرزادی در متابولیسم کربوهیدرات‌ها است که به علت فقدان یا نارسایی آنزیم‌هایی که در حالت طبیعی گالاکتوز را به گلوکز تبدیل می‌کنند، ایجاد می‌شود.

در کودکان مبتلا به گالاکتوزمی پس از چند نوبت  تغذیه با شیر (حاوی لاکتوز بالا) علائم بیماری بروز می‌کند. لاکتوز از نظر شیمیایی یک ترکیب دو قندی است که در محیط روده کوچک، تحت‌ تأثیر آنزیم لاکتاز ترشح شده از سلولهای جداره داخلی روده، به دو قند گلوکز و گالاکتوز تبدیل می‌گردد. حضور این آنزیم برای هضم و جذب لاکتوز شیر ضروری است، زیرا تنها قندهای ساده، قادر به عبور از دیواره روده کوچک و ورود به جریان خون هستند. در حالت طبیعی گالاکتوز در کبد به گلوکز تبدیل می‌شود. در صورت عدم وجود آنزیم‌های تبدیل‌کننده، گالاکتوز و متابولیت‌های آن در خون و ادرار تجمع می‌یابند. کودکان مبتلا به گالاکتوزمی در هنگام تولد سالم به نظر می‌رسند، اما پس از چند نوبت تغذیه با شیر، به‌ تدریج نقص‌های آنزیمی پدیدار می‌شوند. بیماری گالاکتوزمی در صورت عدم درمان، در روزها و هفته‌های اول بعد از تولد می‌تواند یک بیماری شدیداً تهدیدکننده باشد.

ضرورت انجام تست: به منظور پیشگیری یا کاهش مرگ‌ و میر و بیماری و در جهت بهبود پیامدهای بالینی در نوزادان مبتلا و بهبود کیفیت زندگی در کودکان بزرگتر مبتلا.

نوع نمونه: لکه خون خشک شده بر روی کاغذ واتمن (DBS)

نحوه جمع آوری نمونه: برای نمونه گیری آمادگی خاصی لازم نیست، این آزمایش از طریق نمونه گیری از پاشنه ی پا در نوزادان تازه متولد شده و خون وریدی یا از طریق خون نوک انگشت برای سایرین و انتقال آن بر روی کاغذ گاتری قابل انجام است.

شرایط نگهداری نمونه قبل از انجام آزمایش: نمونه بعد از خشک شدن در دمای اتاق، می بایست همراه با سیلیکاژل در زیپ کیپ قرار داده شود و تا قبل از انجام آزمایش در یخچال نگهداری شود.

اساس آزمایش (نوع تکنیک، آماده سازی نمونه، واحد اندازه گیری): در این روش سنجش گالاکتوز و گالاکتوز 1-فسفات بر اساس بهره گیری از آنزیم الکالین فسفاتاز (AP) و گالاکتوز دهیدروژناز (GDH) به صورت شکل زیر انجام می گیرد. به دلیل اختصاصی بودن آنزیم، عوامل خارجی یا مصرف آنتی بیوتیک توسط نوزاد تاثیری در نتیجه آزمایش ندارد.

گالاکتوز-1-فسفات استخراج شده از خون خشک شده روی دیسک کاغذی در اثر آنزیم AP به گالاکتوز و گالاکتوز در اثر آنزیم GDH و در حضور NAD اکسید شده، به گالاکتونولاکتون تبدیل می گردد. NADH بوجود آمده در این واکنش همزمان اندیکاتور را احیاء کرده و به رنگ صورتی مایل به قرمز تبدیل می کند. این تغییر رنگ در طول موج 490 نانومتر اندازه گیری می شود.

مدت زمان فرآیند آزمایش در مرکز تحقیقات رشد و تکامل: یک هفته  

چگونگی تفسیر نتایج:

نام آزمایش: تیروئید نوزادی (Neonatal TSH)

معرفی تست: این تست برای اندازه‌گیری غلظت TSH در لکه خون خشک شده به روش ایمونو آنزیماتیک (الایزا) می‌باشد. کم‌کاری غده تیروئید در دوران جنینی می‌تواند اختلالات غیرقابل‌ بازگشت ساختاری و عملکردی در سیستم عصبی مرکزی و اسکلتی ایجاد کند اما انتقال تیروکسین مادری از طریق بندناف به جنین از بروز علائم بالینی بارز در بدو تولد جلوگیری می‌کند. باتوجه ‌به خفیف بودن علائم این بیماری در روزهای اول زندگی، معمولاً تشخیص این نارسائی با تأخیر صورت می‌گیرد و منجر به ازدست‌ دادن ضریب هوشی در درجات مختلف می‌شود، بنابراین انجام تست غربالگری TSH نوزادان به روش الایزا از اهمیت بالایی برخوردار است.

ضرورت انجام تست: این تست جز تست های غربالگری می باشد و می بایست در سن 3 الی 5 روزگی نوزاد انجام شود در موارد غیرغربالگری زردی طول کشیده، اشکالات تغذیه ای، شلی نوزاد و ضعف عضلانی (هیپوتونی)، بزرگی زبان، تاخیر بلوغ استخوانی و تاخیر در رشد و فتق نافی. نکته مهم این است که در صورت تاخیر درمان، علایم نورولوژیک (علائم مغزی عصبی ناشی از کم کاری تیروئید) دائمی ایجاد خواهند شد و کودک دچار عقب ماندگی ذهنی می شود.

نوع نمونه: لکه خون خشک شده بر روی کاغذ واتمن (DBS)

نحوه جمع آوری نمونه: برای نمونه گیری آمادگی خاصی لازم نیست، این آزمایش از طریق نمونه گیری از پاشنه ی پا در نوزادان تازه متولد شده و خون وریدی یا از طریق خون نوک انگشت برای سایرین و انتقال آن بر روی کاغذ گاتری قابل انجام است.

شرایط نگهداری نمونه قبل از انجام آزمایش: نمونه بعد از خشک شدن در دمای اتاق، می بایست همراه با سیلیکاژل در زیپ کیپ قرار داده شود و تا قبل از انجام آزمایش در یخچال نگهداری شود.

اساس آزمایش (نوع تکنیک، آماده سازی نمونه، واحد اندازه گیری): این تست بر اساس روش ایمونوآنزیماتیک ساندویچی با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال می باشد. در این روش ابتدا از لکه های خون خشک شده بر روی کاغذ فیلتر حاوی خون نوزادان، استانداردها و کنترل ها، دایره هایی به قطر 3 میلی متر جدا کرده و درون چاهک ها قرار می دهند. آنالیت TSH طی دو مرحله بین آنتی بادی تثبیت شده در ته چاهک های پلی استایرنی و آنتی بادی دوم متصل به آنزیم پراکسیداز (HRP) که شاخص های آنتی ژنیک متمایزی را روی مولکول TSH شناسایی می کنند، قرار می گیرد.

پس از شستشو و خارج کردن آنالیت های غیر متصل با افزودن سوبسترا، تترا متیل بنزیدین (TMB)، آنزیم رنگ آبی ایجاد می کند. با اضافه نمودن محلول متوقف کننده، رنگ آبی به زرد تبدیل می شود. شدت رنگ ایجاد شده که با غلظت TSH ارتباط مستقیم دارد، در طول موج 450 نانومتر (با دیفرانسیل 630 نانومتر) اندازه گیری می گردد.

مدت زمان فرآیند آزمایش در مرکز تحقیقات رشد و تکامل: یک هفته  

چگونگی تفسیر نتایج: رنج نرمال: <5µIU/ml

نام آزمایش: غربالگری بیوتینیداز نوزادی (Neonatal Biotinidase Screening)

معرفی تست: این تست برای تشخیص نوزادان مبتلا به نقص آنزیم بیوتینیداز یا BD انجام می شود. آنزیم بیوتینیداز بصورت معمول در داخل بدن مسئول باز‌یافت بیوتین متصل شده به پروتئین‌ها (غالباً آنزیم‌های کربوکسیلاز) می‌باشد. بیوتین در این پروتئین‌ها به عنوان کوفاکتور از طریق اسید آمینه لیزین موجود در ساختمان این پروتئین‌ها به آنها متصل می‌شود.

نقص بیوتینیداز یک اختلال ارثی است که با عدم توانایی بدن در جذب و استفاده مجدد از ویتامین بیوتین مشخص می‌شود. بیوتین عضوی از خانواده ویتامین B می‌باشد که برای متابولیسم و گوارش غذا در بدن ضروری بوده و به متابولیزه شدن چربی‌ها و پروتئین‌ها در بدن کمک می‌کند.

بیماری نقص بیوتینیداز به علت فقدان آنزیم بیوتینیداز یا نقص عملکرد این آنزیم بوجود می‌آید. این بیماری در دسته اختلالات مولتیپل کربوکسیلاز طبقه‌بندی می‌شود. بیوتین به عنوان کوفاکتور، برای فعال شدن آنزیمهای کربوکسیلاز در بدن ضروری است، بنابراین بعد از اتصال بیوتین به یک اسیدآمینه لیزین در آنزیم‌های کربوکسیلاز (آپوکربوکسیلاز)، آنزیم فعال می‌شود. (هولوکربوکسیلاز). وقتی آنزیمهای کربوکسیلاز در بدن تجزیه می‌شوند، بیوتینیل-لیزین تولید می‌شود. بیوتینیل-لیزین (Biocytin) تولید شده توسط آنزیم بیوتینیداز، هیدرولیز شده و بیوتین آزاد تولید می‌شود که می‌تواند مجدداً در دسترس آنزیمهای کربوکسیلاز تجزیه نشده قرار گیرد. بنابراین در افراد مبتلا به نقص بیوتینیداز، بیوتین بدن کاهش می‌یابد که این کاهش منجر به نقص در فعالیت آنزیم‌های کربوکسیلاز می‌شود. در نتیجه مشکلاتی در گلوکونئوژنز، ساخت اسیدهای چرب و کاتابولیسم اسیدهای آمینه (با توجه به نقش کربوکسیلازها در آنها) ایجاد می‌گردد.

نوزادان مبتلا به نقص بیوتینیداز در ابتدای تولد سالم به نظر می‌رسند. سن شروع علائم و نشانه‌های این نقص بسته به میزان دریافت بیوتین و همچنین میزان فعالیت آنزیم بیوتینیداز ممکن است در چند هفته ابتدای تولد یا چند سال بعد از تولد متغیر باشد، ولی معمولاً زمان بروز علائم بیماری در 3 تا 6 ماهگی می‌باشد. بسته به میزان فعالیت آنزیم بیوتینیداز، دو فرم نقص شدید و نقص نسبی در این بیماری دیده می‌شود.

ضرورت انجام تست: سستی ماهیچه‌ها، راش‌های پوستی و ریزش مو به خصوص در زمان ایجاد بحرانهای متابولیک مثل عفونتهای مزمن.

نوع نمونه: لکه خون خشک شده بر روی کاغذ واتمن (DBS)

نحوه جمع آوری نمونه: برای نمونه گیری آمادگی خاصی لازم نیست، این آزمایش از طریق نمونه گیری از پاشنه ی پا در نوزادان تازه متولد شده و خون وریدی یا از طریق خون نوک انگشت برای سایرین و انتقال آن بر روی کاغذ گاتری قابل انجام است.

شرایط نگهداری نمونه قبل از انجام آزمایش: نمونه بعد از خشک شدن در دمای اتاق، می بایست همراه با سیلیکاژل در زیپ کیپ قرار داده شود و تا قبل از انجام آزمایش در یخچال نگهداری شود.

اساس آزمایش (نوع تکنیک، آماده سازی نمونه، واحد اندازه گیری): بیوتینیداز موجود در نمونه‌های DBS با یک بافر حاوی سوبسترای مصنوعی بیوتین 4-آمیدو بنزوئیک اسید (B-PAB) استخراج می‌شود. آنزیم بیوتینیدازف آزادسازی اسید 4 آمیدوبنزوئیک آزاد (PABA) از B-PAB را کاتالیز می کند. واکنش توسط اسید تری کلرواستیک با دناتوره کردن بیوتینیداز، متوقف می شود. سپس واکنش رنگی شروع می شود: PABA تولید شده با نیتریت سدیم واکنش می دهد تا یک ترکیب دیازوته تشکیل شود (نیتریت بیش از حد با سولفامات آمونیوم خنثی می شود). پس از آن ترکیب دیازوته با NED واکنش می دهد و رنگ آزو تشکیل می دهد. رنگ ارغوانی تولید شده را می توان با یک فتومتر در 550 نانومتر رنگ سنجی اندازه گیری کرد که با فعالیت بیوتینیداز موجود در نمونه نسبت مستقیم دارد.

مدت زمان فرآیند آزمایش در مرکز تحقیقات رشد و تکامل: یک هفته  

چگونگی تفسیر نتایج:

نام آزمایش: تریپسینوژن ایمنی واکنشی Immunoreactive Trypsinogen (IRT)

معرفی تست: تریپسینوژن یک پیش ساز غیرفعال بوده که توسط پانکراس تولیده شده و به آنزیم تریپسین تبدیل می شود. این آزمایش میزان تریپسینوژن را در خون اندازه گیری می کند.

در حالت طبیعی، تریپسینوژن در پانکراس تولید شده و به روده کوچک منتقل می شود. در روده کوچک، فعال شده و به تریپسین تبدیل می گردد. تریپسین یکی از آنزیم های مسئول تجزیه پروتئین موجود در خون به قطعات کوچکتری با عنوان پپتید می باشد. بدون تریپسینوژن و تریپسین کافی، فرد قادر نخواهد بود که پروتئین ها را به درستی هضم کرده و از آنها استفاده کند. هر عارضه ای که از رسیدن تریپسینوزن به روده کوچک جلوگیری کند، ممکن است باعث افزایش تریپسینوژن در خون شود.

در افراد مبتلا به سیستیک فیبروزیس (CF)، پلاگ های مخاطی، مجراهای پانکراس را که به روده کوچک منتهی می شوند، مسدود کرده و از رسیدن تریپسینوژن به روده و به تبع آن تجزیه پروتئین های غذا جلوگیری می کنند. نوزادان مبتلا به CF ممکن است سطوحی بالا از IRT را داشته باشند.

ضرورت انجام تست: حالت تهوع، استفراغ، ضعف، زردی پوست و/یا چشم (یرقان) و تب

نوع نمونه: لکه خون خشک شده بر روی کاغذ واتمن (DBS)

نحوه جمع آوری نمونه: برای نمونه گیری آمادگی خاصی لازم نیست، این آزمایش از طریق نمونه گیری از پاشنه ی پا در نوزادان تازه متولد شده و خون وریدی یا از طریق خون نوک انگشت برای سایرین و انتقال آن بر روی کاغذ گاتری قابل انجام است.

شرایط نگهداری نمونه قبل از انجام آزمایش: نمونه بعد از خشک شدن در دمای اتاق، می بایست همراه با سیلیکاژل در زیپ کیپ قرار داده شود و تا قبل از انجام آزمایش در یخچال نگهداری شود.

اساس آزمایش (نوع تکنیک، آماده سازی نمونه، واحد اندازه گیری): این تست بر اساس ایمونو آنزیماتیک انجام می شود. به این صورت که چاهک های پلیت با یک آنتی بادی ضد IRT پوشانده شده اند که IRT موجود در نمونه را جذب می کند. پس از انکوباسیون و یک مرحله شستشو برای حذف مواد غیر متصل، یک آنتی بادی ضد IRT بیوتینیله به کالیبراتورها و نمونه ها اضافه می شود. پس از مرحله دوم شستشو، استرپتاویدین پراکسیداز به چاهک ها اضافه می شود که با میل ترکیبی بالایی به بیوتین متصل می شود. پس از سومین انکوباسیون و یک مرحله شستشو، immuno-complex با کاهش 3.3’-5.5’-tetramethylbenzidine (TMB) توسط HRP شناسایی می شود. ایجاد رنگ آبی با مقدار آنتی ژن در نمونه یا استاندارد نسبت مستقیم دارد. واکنش آنزیمی با افزودن اسید سولفوریک متوقف می شود و جذب در طول موج 405-450nm با استفاده از دستگاه ELISA Reader خوانده می شود.

مدت زمان فرآیند آزمایش در مرکز تحقیقات رشد و تکامل: یک هفته  

چگونگی تفسیر نتایج: Cut-off at 71.2µg/L